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Hepatology:m6A RNA甲基化酶METTL3促肝癌发展新玄机

发布于:2017-12-13 16:21:25 点击量:1649

导读

近年来,m6A RNA修饰的研究已成为当今生命科学领域最前沿最热门的研究方向之一,不断有CNS的文章问世,m6A RNA修饰的催化、去除以及识别的分子机理研究越来越清晰,而人们更关心的似乎是m6A RNA修饰与重大疾病例如肿瘤之间的相关性。表观遗传的改变极大得促进了人类癌症的发展,近期Hepatology的一篇题为“RNA N6-methyladenosine methyltransferase METTL3 promotes liver cancer progression through YTHDF2 dependent post-transcriptional silencing of SOCS2” 文章报道了m6A修饰在肝癌中的作用。


在本研究中,作者通过转录组测序发现m6A甲基化酶METTL3在人肝癌及其它恶性肿瘤中显著上调,并且其过表达预示着较差的临床预后。体外实验表明METTL3可促进肝癌细胞的增殖,侵袭和克隆形成。体内实验也表明METTL3可促进肝癌成瘤能力和肺侵袭能力。接下来,通过比较转录组测序,m6A测序及MeRIP-qPCR结果作者发现SOCS2可作为METTL3介导的m6A修饰的靶基因。敲除METTL3可破坏SOCS2RNA甲基化水平,并上调其mRNA表达水平。作者还发现m6A介导的SOCS2 mRNA降解是依赖于m6A读取蛋白YTHDF2的。本研究为肝癌表观水平改变的研究提供了新的维度。


1.m6A甲基化酶METTL3在肝癌中表达上调,并预示着较差的临床预后 

通过对16HBV相关的肝癌和对应的非癌症组织进行RNAseq,作者发现m6A甲基化转移酶核心成分METTL3显著上调,这一结果与TCGA数据库中50对肝癌患者的数据一致。接下来,作者在104对肝癌和正常肝组织中进行qPCR验证,发现和测序结果一致,METTL3都显著上调,并且其m6A水平也是显著高表达的。此外,高表达的METTL3与较差的预后显著相关,这提示我们METTL3在肝癌中的上调有可能促进肝癌的发生发展。


图示:METTL3在肝癌中的表达及其与生存力的关系

2.METTL3促进肝癌的发生发展 

作者通过shMETTL3#1shMETTL3#2稳定敲低HepG2Huh-7细胞的METTL3,体外实验表明敲低METTL3可抑制肝癌细胞的增殖,克隆形成及侵袭作用。此外,通过皮下接瘤实验发现敲除METTL3可抑制成瘤能力和生长速率。另外,作者还通过CRISPR/dCas9-VP64/MS2-p65-HSF1基因激活系统过表达MHCC97L细胞的内源性METTL3,发现METTL3过表达可促进肝癌的增殖和侵袭。综上所述,METTL3可促进肝癌的发生发展。




图示:敲低METTL3可抑制肝癌细胞的增殖和侵袭



图示:敲低/METTL3可抑制肝癌细胞的增殖和侵袭



图示:过表达METTL3可促进肝癌的发生发展


3.RNA-seqm6A-seq共同鉴定SOCS2METTL3介导的m6A修饰下游的靶基因  

接下来,通过比较转录组测序,m6A测序及MeRIP-qPCR结果作者发现SOCS2可作为METTL3介导的m6A修饰的下游靶基因。




图示:RNA-seqm6A-seq共同鉴定SOCS2METTL3介导的m6A修饰下游的靶基因


4.METTL3通过m6A阅读器YTHDF2依赖的通路抑制SOCS2mRNA稳定性

作者首先通过MeRIP-qPCR证实了SOCS2mRNA受到METTL3m6A修饰调控。为了探究m6A修饰是如何影响SOCS2表达的,作者构建了野生型和突变型SOCS报告mini基因。对于突变报告mini基因而言,m6A的共有序列(比如RRACH)中A被替换成C,从而消除m6A修饰。作者发现突变了SOCS2后显著增加了SOCS2的表达,通过比对荧光活性,还发现在野生型的SOCS2融合人报告基因的荧光强度在沉默METTL3后被显著放大。然而,敲低METTL3对突变型的SOCS2融合报告基因没有影响。以上结果表明SOCS2的表达水平是由METTL3m6A修饰调控的。另外,从测序结果中作者发现YTHDF2结合位点与m6A修饰位点很接近。因此作者通过敲低YTHDF2,结果发现SOCS2表达显著上调。上述结果都再次证实METTL3通过m6A阅读器YTHDF2依赖的通路抑制SOCS2mRNA稳定性。


图示:SOCS2表观沉默是通过METTL3-m6A-YTHDF2依赖的机制实现的

5.SOCS2抑制肝癌的发展

本研究到这,已经发现METTL3敲除可增加SOCS2mRNA和蛋白表达,因此作者对上述的102对肝癌组织和相应的正常肝组织进行qPCR,发现SOCS2在肝癌细胞中显著下调,且其中88.2%下调倍数大于2。通过体外实验验证,作者发现SOCS2可已知肝癌的发生发展。结合TCGA数据库,发现SOCS2METTL3表达负相关。综上所述,SOCS2METTL3下游的靶基因,在肝癌中发挥抑制作用。


图示SOCS2作为肿瘤抑制基因,与METTL3表达负相关


参考文献RNA N6-methyladenosine methyltransferase METTL3 promotes liver cancer progression through YTHDF2 dependent post-transcriptional silencing of SOCS2




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