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Nature Communications:环状RNA 参与干细胞分化

发布于:2017-12-04 13:18:14 点击量:563


近日Nature Communications IF12.124杂志在线发表了台湾中央研究院Kuo Hung-Chih为通讯作者的文章,报道发现circBIRC6可参与干细胞多能性调控。总结下来,作者利用了环状RNA开山之作Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency”一文中的数据通过一系列质控手段找到了3个目标环状RNA,其中circBIRC6circCORO1ChESCs细胞的分化状态密切相关circBIRC6通过竞争性结合miR-34a以及 miR-145,抑制细胞分化更有意思的是作者发现circBIRC6的形成受到 hESCs细胞中经典剪切因子 — ESRP1调控,ESRP1又受OCT4 以及 NANOG调控篇文章作者列举大量锤证实了circBIRC6与干细胞分化息息相关。接下来,咱们就看看作者摆出的实锤有哪些?

干细胞分化相关环状RNA筛选




作者的指标筛选基于2013年环状RNA Nature文章数据,1954个环状RNA中找出61junction reads > 40;之后基于RNaseR耐受性实验筛选出20个真环状RNA;作者又分别验证了它们在hESCs细胞中表达量,

得到11例高表达环状RNA;最终根据干细胞相关表型筛选出3例环状RNA与细胞分化状态相关。它们是:circBIRC6circCORO1C以及circMAN1A2

目标分子既可通过自己测序,也可根据数据库已有数据分析得到,但作者竟然直接利用环状RNA祖师爷的数据来筛选,这也提示我们一套高通量测序数据挖掘潜力无限大。


实锤二目的环状RNA是否参与干细胞分化

经过初筛,得到了三个环状RNA,但它们是否参与干细胞多能性调控?为此,作者设计了RNA干扰实验,针对这些环状RNA构建了敲除体系。结果表明,干扰后,circBIRC6circCORO1CAP染色阳性率明显减少,而干扰circMAN1A2后作用并不明显。当抑制circBIRC6circCORO1C表达qPCR验证与分化相关marker的表达也受到影响。不止如此,作者还证实干细胞分化状态仅与环状RNA相关,并不受其来源线性RNA调控。


图:环状RNA敲降实验,AP染色及分化相关marker验证


找到目的分子后,也是建议大家先做个功能获得/缺失看看,有了细胞表型,咱在往下做,要是没有么,可能还要反过头来再找找看。


实锤三目的环状RNA调控干细胞分化下游机制

目的环状RNA有了细胞表型也看到了那么就来到解开下游机制奥秘的时刻说到环状RNA,大家最熟悉的就是miRNA海绵机制ceRNA机制),这项工作也不例外。这个机制作者太熟悉了,下面也就跟大家唠唠家常,说说这个机制到底是怎么一回事。要做海绵机制,第一项工作就是看看目的环状RNA细胞定位,咱们心里要有个数,定位在胞质中,那海绵机制就有谱了;要是定位在核里,那海绵机制就走远了。这不,作者发现他找到的目标分子都定位在细胞质中。接下来也是大家很容易忽略的一个关键步骤,做个AGO2 RIP实验,看看环状RNA与这个蛋白有没有结合,AGO2蛋白可是海绵机制的指示蛋白,只有结合了才有希望是海绵机制。作者通过这一实验证实了circBIRC6AGO2结合,而circCORO1C很不幸的就此OUT锚定了目的环状RNA后,可先通过生信分析找与其结合的miRNA(本文采用PITA算法,预测了与细胞分化相关且与circBIRC6结合的miRNAmiR-34amiR-145)。计算机预测的结果肯定不能当实锤,想证明miRNAcircRNA真的结合,RNA pull down实验是必不可少的,作者也利用这个实验证实circBIRC6与这两个miRNA直接结合。一个锤子不够重,那就再补一个,到了这一步咱可以再来个Luciferase Assay,这时作者不光告诉了我们circRNAmiRNA相互作用,甚至还告诉了我们它们的作用位点是哪里。


环状RNA 海绵机制验证实验

多数环状RNA海绵机制文章到这里就戛然而止了这篇文章的最大亮点在于作者不光把下游机制的路走通了还开辟了上游环状RNA形成机制的路



实锤四:干细胞经典剪切因子调控目的环状RNA形成

下游的路走完了咱往上游走一走看看有什么新发现作者发现当hESCs中剪切因子ESRP1过表达时,circBIRC6表达显著受到抑制。通过RIP实验证实ESRP1circBIRC6直接结合;若把circBIRC6上下游作用位点突变后,ESRP1将不能与其结合。

到这里还没完,作者逆流向上,继续找出了调控ESRP1的基因—NanogOct4。基于ENCODE ChIP-seq数据库,作者发现ESRP1启动子区域存在NanogOct4结合位点,且存在干细胞特异性H3K27Ac修饰(转录活化相关)。通过ESRP1 Promoter Luciferase Assay证实了前期预测的调控方式。

circBIRC6形成上游调控机制


总结:文章到这里圆满的结束了,本文首次报道了环状RNA与干细胞分化具有相关性。作者列出诸多 “实锤”,证实下游环状RNA通过海绵机制调控干细胞分化,上游受NanogOct4调控的ESRP1剪切因子直接参与环状RNA的成熟剪切。本文无论是其行文思路亦或实验设计都很值得我们借鉴。

原文:The circular RNA circBIRC6 participates in the molecular circuitry controlling human pluripotency





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