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如何利用RNA甲基化测序数据发表10分文章

发布于:2017-07-17 10:18:36 点击量:811

导读:俗话说,物以稀为贵。而在科学研究中,我们一般会认为“物以新为贵”。比如早在2015年,circRNA刚刚引起人们关注的时候,一篇仅仅做胎猪不同发育时期脑组织中circRNA表达谱的文章就可以发表在Genome biology[1],而如今,类似的环状RNA表达谱文章只能够发在Oncotarget上了。虽然这并不排除文章研究深度不同造成的差异,可也从另一层面说明了相同的工作量的前提下,热点和新颖的研究内容能帮助我们发表高分文章。从2016年开始,RNA甲基化研究逐渐起步,却也成为了一个新的科研热点。在昨日的微信文章中,我们系统介绍了目前m5C RNA甲基化检测手段。今天,我们就来介绍一篇仅仅做RNA m5C修饰图谱,于今年1月份发表在Genome Biology的文章。 


近年来,围绕RNA甲基化修饰m6A的产生机制和生物学功能已有大量的文献报道,然而mRNA上的另一种修饰m5C(5-甲基胞嘧啶)长期以来却较少的受人重视。此前,我们在公众号解析过一篇今年4月份中科院基因组所在Cell Research上发表的RNA m5C分布图谱和作用机制的文章[2]。那么不深入研究作用机制,仅仅构建RNA m5C在不同组织细胞的分布图谱如何发表10分文章呢?这篇Genome Biology告诉你答案。


1.RNA Bis-seq检测m5C在不同细胞的分布

首先,研究人员选取小鼠胚胎干细胞(ESCs)和脑组织(n=3)作为实验样本,利用重亚硫酸盐测序(RNA Bis-seq)技术对两组样本中的总RNA和胞核RNA进行检测。结果表明,ESC中总RNA m5C的分布频率(5.5 sites/gene)比脑组织的分布频率(3sites/gene)更高,这些m5C位点分布在多种转录本中。另外,相比总RNA,胞核RNA中m5C的分布频率(6.9 or8 sites/gene)在两组样本中也明显增高。

图注:RNA Bis-seq检测m5C在不同样本的分布

 

2.MeRIP-qPCR验证m5C修饰RNA的表达

为了验证Bis-seq结果的准确性,研究人员首先设计具有不同二级结构的RNA寡聚体,利用质谱技术,发现重亚硫酸盐处理确实能够转化这些二级结构中的胞嘧啶,证实了Bis-seq技术的可靠。随后,研究人员随机选取可16条发生m5C修饰RNA,利用m5C特异性抗体进行MeRIP-qPCR实验。结果表明,其中13条转录本都有m5C的存在。

MeRIP-qPCR验证m5C修饰RNA的表达

 

3.不同样本中共有和特异存在的m5C位点

为了检测不同样本间差异存在的m5C,研究人员把m5C位点分成两种:unique(只存在于一组样本中的m5C位点)和common(两组样本中都存在的m5C位点),结果共发现ESC中4461个unique位点,脑组织中共有921个unique位点。进一步分析表明这些unique位点的存在并不依赖于不同组织产生的不同的转录本,相反,它们是组织特异性存在的。对这些unique位点相关的RNA进行GO分析,发现大部分RNA都与细胞代谢和细胞特异性的功能相关。


m5C在不同样本的差异表达

 

4.m5C位点的基因组位置与功能预测

为了更好的了解m5C位点的分布,研究人员将m5C位点和不同的基因组区域(CDS, 5’-UTR, 3’-UTR等)进行了关联分析。结果表明,总RNA中m5C位点更倾向于分布在转录起始位点,而CDS区没有m5C的分布。另外,脑组织和ESC中,3’-UTR区m5C的分布有很大不同,这暗示着3’-UTR区的RNA甲基化可能于细胞功能和细胞类型密切相关。


图注:m5C的基因组位置分布

由于之前有文章报道过m5C的位置和AGO结合位点相关,然而,在本文中研究人员发现m5C的位置和miRNA结合位点没有关系。随后,研究人员想进一步验证RNA结合蛋白(RBPs)与m5C位置的关系。在ESC和脑组织的总RNA中,分别有29%和11%的m5C位点与RBPs结合位点重叠。进一步分析表明,m5C的存在可能与特定的RBP相关,而不是从整体水平上调控蛋白的结合。


图注:m5C位点与特定的RBP结合位点相关

 

参考文献:

[1]. Jørgen Kjems, et al. Spatio-temporal regulation of circular RNA expression during porcine embryonic brain development. Genome Biology, (2015) 16:245.

[2]. Yungui Yang, et al. 5-methylcytosine promotes mRNA export — NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research (2017) :1-20.

[3]. Alexandra Lusser, et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A)RNA from mouse embryonic stem cells and brain. (2017) 18:1.


 


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